p3P-Considérations initiales pour l’expression de protéines

Chaque protéine est différente et il n’existe pas de recette universelle permettant de garantir qu’une protéine donnée sera exprimée et purifiée tout en conservant son activité et son intégrité structurelle. Cependant, il existe un certain nombre de considérations initiales au début du projet qui peuvent augmenter les chances de succès. Voici les plus importantes :

-1) Obtenez le plus d’informations possible : 

connaître la protéine que vous envisagez d’exprimer est important et peut éviter de nombreux pièges.

Informations minimales sur la protéine :

• Séquence protéique
• séquence cDNA
• MW
• PI calculé
• Coefficient d’extinction
• Origine
• Localisation subcellulaire
• Fonction biologique, activité enzymatique
• Cofacteurs si connus
• Qu’il forme ou non un complexe stable et quels sont les partenaires connus
• Historique de production antérieur (et autant de détails que possible sur ces tentatives)
• Production réussie d’orthologues
• Présence et description de domaines structurels/fonctionnels
• Présence d’une région intrinsèquement déstructurée (IDR)
• Modification post-traductionnelle requise ?

Objectif de la production :

• Usage?
• Quantité minimale requise (mg et concentration) ?
• Qualité minimale requise (pureté, contaminant à éviter, lesquels ?)
• Bioactivité requise (moyen de surveiller cette activité ?)
• Suppression de l’étiquette d’affinité requise, indifférente ou étiquette d’affinité nécessaire pour une application en aval ?

Matériel disponible : cDNA, plasmide d’expression, stratégie de clonage ?

-2) Sélection du système d’expression

Le choix du système d’expression dépend de plusieurs paramètres :

• Origine de la protéine ; Les protéines d’origine eucaryote présentent un défi plus important pour l’expression chez les procaryotes.
• Modifications post-traductionnelles ; si elle est importante pour l’activité ou la stabilité, elle déterminera le choix du système d’expression.
• Coût et facilité d’utilisation ; l’expression bactérienne est la plus simple, la moins chère et la plus rapide à mettre en place (à quelques exceptions près comme l’expression in vitro) ; cela donne un très bon rendement pour des protéines qui se comportent bien.

P3P fournit des vecteurs et des souches pour l’expression dans les systèmes suivants (pour plus de détails, rendez-vous sur cette page)

• E. coli
• Cellules d’insectes/baculovirus
• Pichia pastoris (en développement)
• Expression in vitro (lysat BY-2 commercial ALiCE)

-3) Conception de la construction

Etiquettes d’affinité (Tags) : ils faciliteront la purification de la protéine cible par chromatographie d’affinité. L’étiquette standard et minimale pour l’expression d’E.coli est 6xHis (soit à l’extrémité N ou C-terminale) et chromatographie d’affinité. Les autres tags courants disponibles avec affinité incluent MBP, GST, StrepII. les balises peuvent considérablement améliorer la solubilité de la cible et empêcher l’agrégation. Les balises MBP, Sumo et HLT sont le premier choix pour leur effet dans ce domaine. Enfin, ils peuvent fournir un contexte d’initiation à la traduction optimisé et favoriser une traduction efficace.

Définition du domaine : les protéines eucaryotes sont souvent composées de plusieurs domaines structurellement et fonctionnellement distincts. Selon l’application, il peut être préférable d’omettre certains domaines de la protéine. L’analyse bioinformatique des séquences et la prédiction de la structure peuvent aider à la délimitation de la séquence à exprimer.

Optimisation de la séquence : les différences dans l’utilisation des codons peuvent conduire à une mauvaise expression de la séquence eucaryote dans E.coli (et vice versa). Le coût relativement faible de la synthèse de séquences rend l’optimisation des séquences intéressante (et permet également la domestication des sites de restriction Goldengate). Cependant, si l’on envisage l’expression dans plusieurs systèmes d’expression, l’optimisation pourrait s’avérer contre-productive. Pour l’optimisation génétique, GeneSmart fourni gratuitement (pour l’instant) par GeneScript peut être utilisé.

À la lumière des considérations ci-dessus et s’il n’y a pas de contre-indication sérieuse, l’expression d’E.coli est généralement choisie comme première approche compte tenu de sa simplicité et de son coût.

Nous maintenons des vecteurs adaptés au clonage GoldenBraid pour tous les systèmes d’expression disponibles sur P3P. Nous recommandons donc fortement de cloner la séquence d’intérêt en tant que module B4 GoldenBraid (voir le protocole de clonage pour plus de détails). Il permet un clonage presque transparent, une interopérabilité entre les systèmes et une flexibilité.

Des informations, protocoles et ressources spécifiques peuvent être trouvés dans la section Systèmes d’expression.