PCR quantitative en temps réel

Instruments

Light Cycler 480 – Roche

• Blocs pour microplaques 96 et 384 puits
• Détection en SYBRGreen, Taqman, UPL Roche….
• Génotypage et HRM

Robot de pipetage Biomek3000

• Poste informatique pour la programmation et pilotage du robot
• Têtes de pipetage 1 ou 8 canaux
• Pipetage de 1µL à 200 µL

 

Accès aux consommables

SYBR Green

Le mix de SYBRGreen est disponible au magasin par tubes de 2 ml (référence 10079).

Microplaques blanches de 384 puits et films optiques

Vous trouverez les plaques et les films dans un carton situé à coté de l’instrument qPCR.

Pointes pour le robot de pipetage

Vous trouverez les pointes P20, P50 et P200 dans les cartons sous le robot de pipetage.

Accès aux appareils et réservation

•  L’utilisation des instruments se fait sous réserve d’avoir pris connaissance du mode de fonctionnement des instruments auprès du personnel de la plateforme ou d’autres utilisateurs confirmés.
• Une fois formé, vous pouvez vous aider des instructions d’utilisation des instruments, LightCycler480 et Biomek3000 (disponibles dans le labo, ne les imprimez pas)
• Les utilisateurs s’engagent à respecter le protocole d’utilisation des appareils et à ne pas installer de logiciels sur les ordinateurs de la plateforme.
• Les réservations pour le LC480 et le robot de pipetage Biomek 3000 sont obligatoires et se font sur le site intranet de l’IBMP. Ces réservations se font par créneau d’1h qui correspond à la durée d’un run standard sur le LC480. Pensez à ajuster la plage de réservation si vous utilisez des protocoles particuliers.
• Organisez-vous pour que votre run soit lancé à l’heure de la réservation de façon à ne pas pénaliser les utilisateurs suivants !

Règles de bonne conduite

• Enregistrer vos runs d’analyse dans le dossier de sauvegarde attribué à votre équipe de recherche dans lequel vous pouvez créer un sous-dossier à votre nom d’utilisateur. Voici le chemin à suivre : « Roots> QPCR 406>Experiments>QPCR 2020>Dossier d’équipe>Dossier d’utilisateur.
• Récupérez vos fichiers «.ixo », le responsable de la plateforme procèdera à une sauvegarde annuelle sur le serveur de l’IBMP.
• Le PC relié à l’instrument ne sert qu’à piloter l’instrument et ne doit en aucun cas être utilisé pour l’analyse des résultats. Pour l’analyse de vos résultats, un autre PC avec tous les logiciels nécessaires est à votre disposition, en libre accès sur la plateforme.
• La salle et les appareils doivent rester propres après chaque utilisation. Ne laissez pas vos plaques dans l’instrument ni sur la paillasse.
• Veillez à éteindre l’instrument si aucune réservation n’a été programmée après la votre.
• Toute panne ou incident technique doit être signalé au responsable de la plateforme dans les plus brefs délais.

Activités  proposées

Aide à la préparation de la plaque et à l’utilisation du Biomek3000

Protocole Biomek3000

Protocole préparation de la plaque pour Lightcycler et utilisation du LightCycler480.

Test de gènes référence

À partir d’une collection de gènes ; recherche des 2 ou 3 gènes les plus stables pour un organisme donné, pour un tissu donné et dans des conditions expérimentales données.

Logiciels utilisés : Genorm , NormFinder , GeneX.

Ainsi la plateforme dispose de 3 sets de normalisation pour les organismes suivants :

– Arabidopsis thaliana

– Nicotiana tobaccum ( tabac)

– Solanum tuberosum (pomme de terre)

Vous pouvez trouver la liste des amorces et leurs séquences en accès libre sur la plateforme pour les gènes de référence ici.

Dessin des amorces et des sondes

Pour un gène donné : recherche de couples d’amorces ayant les meilleures spécificités et efficacités en Q-PCR pour un protocole défini à l’avance.

Logiciels utilisés :  LightCycler primer Design, LinReg.

Protocole de dessin des amorces avec LightCycler ici,

Protocole de calcul des efficacités avec LinReg ici.

Analyses des résultats

Analyse des résultats de quantification relative par la méthode des ΔΔct et Δct ou de quantification absolue,

Analyses statistiques

Support technique et logiciel

Aider les utilisateurs pour la configuration et la réalisation de leur expérience, support technique pour la synthèse des cDNA.

Formation 

Si vous êtes intéressé par une formation, contactez le responsable de la plateforme.