Séquençage Sanger

Service

Résolution jusqu’à 1100 bases
Séquençage sur diverses matrices en tube ou microplaque (produit de PCR, plasmide, séquençage direct sur colonie ou culture bactérienne)
Suivi personnalisé, expertise et conseil pour matrices « difficiles ».

Comment demander une prestation de séquençage d’ADN ?

Préparation des matrices à séquencer

Pour la préparation de plasmides, il vous est laissé le libre choix de la technique de purification telle la lyse alcaline classique (extraction phénolique) + traitement à la RNase ou utilisation de kits de purification. Dans le cas d’utilisation d’un kit commercial, faites l’élution avec de l’H₂O milliQ et en aucun cas avec le tampon (souvent TE) fourni dans le kit.

La qualité et la quantité de la matrice doivent être contrôlées sur gel d’agarose en présence de témoin de concentration (un pGEM à 200 ng/µL est disponible sur la plateforme).

Ce contrôle doit être accompagné par la mesure de densités optiques: DO à 260 nm et rapport DO-260 nm / DO-280 nm.

Échantillons conditionnés en barrettes de 0,2 ml
(moins de 48 échantillons)

• Les tubes devront contenir 17 µL d’échantillon contenant la matrice d’ADN et l’amorce, préparées selon les conditions recommandées ci-dessous,
• Numérotez les tubes des barrettes (au moins le premier et le dernier tube de la barrette),
• Indiquez vos identifiants sur les bouchons selon la syntaxe suivante : numéro de laboratoire –initiales de l’utilisateur – nombre d’échantillons (exemple : 406-AM-10),
• Remplir le formulaire de séquençage en barrettes. Attention, le nom de vos échantillons doit être court et ne doit pas contenir les caractères  / , . : ‘ @ # ( )
  
•  Enregistrez le formulaire sous : MMDDYYYY-numéro de laboratoire-initiale de l’utilisateur-nombre d’échantillons (exemple : 05282017-406-AM-10),
• Envoyez le formulaire à l’adresse e-mail générique de la plateforme aeg@ibmp-cnrs.unistra.fr avec pour objet du mail « demande de séquençage en barrette »,
• Déposez les échantillons dans le congélateur prévu à cet effet sur la plateforme de séquençage.

Conditionnement en barrettes : 17 µL (matrice + amorce)

MATRICES	QUANTITES	AMORCES
Plasmides	600 ng	> 20 pmoles 17 mère < taille < 25 mère Tm ≥ 50 ° C
produits de PCR	100 ng

Échantillons conditionnés en microplaque de 96 puits
(à partir de 48 échantillons)

• Les plaques à utiliser doivent être compatibles avec le séquenceur. Si vous n’en avez pas, merci de prendre celles qui sont disponibles sur le plateforme, à savoir les plaques semi-jupées Starlab référence E1403-8200.
• Les puits de la plaque contiendront 17 µL d’échantillon contenant la matrice d’ADN et l’amorce, préparées selon les conditions recommandées ci-dessous,
• Remplissez votre plaque en colonne de haut en bas, de la gauche vers la droite (1^er puit : A01, 8^ème puit : H01…dernier puit : H12),
• Identifiez la microplaque  en mentionnant sur le coté , votre nom et la date de demande de séquençage ou un autre identifiant de votre choix .  Ne rien inscrire sur le dessus de la plaque.
• Remplissez le formulaire pour séquençage Sanger en micro-plaque. Attention, le nom de vos échantillons doit être court et ne doit pas contenir les caractères  / , . : ‘ @ # ( )
  
• Enregistrez le formulaire sous : MMDDYYYY-numéro de laboratoire-initiales de l’utilisateur-nombre d’échantillons (exemple : 05282017-406-AM-56),
• Envoyez le formulaire  à l’adresse e-mail générique de la plateforme aeg@ibmp-cnrs.unistra.fr avec pour objet du mail « demande de séquençage en microplaque »,
• Déposez la microplaque dans le congélateur prévu à cet effet sur la plateforme de séquençage.

Conditionnement en microplaques : 17 µL (matrice + amorce) :

MATRICES	QUANTITES	AMORCES
Plasmides	600 ng	> 20 pmoles 17 mère < taille < 25 mère Tm ≥ 50 ° C
produits de PCR	100 ng

Séquençage direct sur culture ou colonie bactérienne, en tube ou en microplaque :

Assurez-vous de choisir une belle et grosse colonie bien isolée, sinon procédez à une mise en culture de 20h ou le temps nécessaire pour avoir suffisamment de bactéries (bonne DO).

Type de souche	QUANTITES
High copy plasmid	1 grosse colonie ou 70 µL de culture
Low  copy plasmid	200 µL de culture

Pour préparer ses plaques de séquençage direct sur colonie, suivre le protocole suivant : 2022-AEG-Méthode de séquençage direct de plasmide sur colonie ou culture bactérienne.

Amorces universelles de séquençage disponibles

Les amorces suivantes, Primers AEG, sont disponibles et en libre service dans le congélateur de la plateforme prévu à cet effet.

Ces amorces sont conditionnées à une concentration de 100 µM. Servez-vous d’un petit aliquot et réalisez vos propres dilutions. Pensez à retourner l’amorce à sa place dans les plus brefs délais afin de ne pas pénaliser les autres utilisateurs.

Vos résultats de séquençage

Vous trouverez vos résultats de séquençage sur Offshore.

Adresse du serveur : smb://offshore.ibmp.unistra.fr/sequencage$/

Vos données sont disponibles 1 mois à partir du jour de dépôt des séquences puis elles seront effacées automatiquement. Il est va de votre responsabilité de les sauvegarder.

Le séquençage de votre échantillon génère deux types de fichiers :

• un fichier « .seq » qui contient la suite de nucléotides sous forme de texte. Vous pouvez le lire avec une application traitement de texte (word, wordpad, textedit, MacVector…),
• un fichier « .ab1 », il s’agit du chromatogramme de séquençage, en couleur qui ne peut être ouvert qu’avec un programme spécifique de traitement des séquences.

Il est important de pouvoir lire ce chromatogramme. En effet il vous donnera une information sur la qualité de votre séquence, la présence d’incertitudes ou d’ambiguïté de séquençage que vous ne pourrez pas soupçonner à la lecture du fichier « .seq ».

Voici une liste non exhaustive de programmes permettant de lire ces chromatogrammes.AB1 selon votre base informatique :

APPLICATION	BASE	Lien de téléchargement
4peak	MAC OSX	http://nucleobytes.com/index.php/4peaks
FinchTV	PC et MAC OSX	http://finchtv.software.informer.com/1.4/
Chromas	PC	http://www.technelysium.com.au/chromas.html
Mac Vector	MAC	IBMP intranet